ANO1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401314-ACT

ANO1 (também conhecido como TMEM16A) codifica um canal de cloreto ativado por Ca2+ que regula a secreção de fluidos epiteliais, a excitabilidade do músculo liso das vias aéreas e do trato gastrointestinal e a dinâmica do potencial de membrana em diversos tipos celulares. Ao se acoplar a sinais intracelulares de Ca2+, o ANO1 influencia o transporte de íons, o controle do volume celular e redes de sinalização dependentes de Ca2+ que se interligam a programas de proliferação e migração. A expressão ou atividade aberrante de ANO1 tem sido associada a fenótipos alterados de secreção epitelial e a uma excitabilidade desregulada, e é frequentemente estudado no contexto da biologia tumoral, na qual o fluxo de cloreto pode modular o crescimento e o comportamento invasivo. Como resultado, ANO1 atua como um nó funcional que conecta a sinalização por Ca2+ à condutância de cloreto e a mudanças subsequentes no estado celular relevantes para o remodelamento associado a doenças.

ANO1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ANO1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ANO1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ANO1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ANO1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ANO1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ANO1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ANO1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ANO1 em células tumorais com expressão de ANO1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.