Ankyrin G Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400421-ACT

L’ANK3 umano codifica l’anchirina G, un adattatore multifunzionale che collega le proteine integrali di membrana al citoscheletro spectrina–actina, organizzando domini di membrana specializzati e stabilizzando complessi proteici. L’anchirina G è essenziale per la polarità e l’eccitabilità neuronale grazie al suo ruolo nel raggruppare i canali del sodio voltaggio-dipendenti e altri componenti nel segmento iniziale dell’assone e nei nodi di Ranvier, e contribuisce anche all’organizzazione della membrana negli epiteli. Attraverso queste funzioni di impalcatura, l’anchirina G influenza il rimodellamento del citoscheletro, il traffico di membrana e le vie di trasduzione del segnale che coordinano l’architettura e la comunicazione cellulare. Studi genetici e di espressione hanno associato la disregolazione di ANK3 a fenotipi neuropsichiatrici e neurosviluppo, sostenendone la rilevanza per la ricerca meccanicistica nei circuiti neuronali e nella biologia dei domini di membrana.

Ankyrin G Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ANK3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ankyrin G Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ANK3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ANK3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ankyrin G. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ANK3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ankyrin G nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ankyrin G nelle cellule tumorali con espressione di ANK3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.