ALKBH8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407123-ACT

ALKBH8 codifica uma oxigenase dependente de 2-oxoglutarato/Fe(II) implicada na modificação de RNA, particularmente na maturação da uridina wobble (U34) em tRNAs específicos, por meio de etapas de metilação e subsequente hidroxilação. Ao modular a eficiência de decodificação do tRNA e a fidelidade translacional, a ALKBH8 conecta a regulação epitranscritômica do RNA à manutenção do proteoma e às respostas celulares ao estresse. A perturbação da atividade de ALKBH8 pode alterar programas de tradução com viés de códons e tem sido associada a fenótipos de proliferação desregulada e instabilidade genômica em sistemas modelo. Essas características tornam a ALKBH8 relevante para estudos de metabolismo de RNA, adaptação ao estresse oxidativo e reprogramação da tradução associada a doenças.

ALKBH8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ALKBH8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ALKBH8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ALKBH8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ALKBH8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ALKBH8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ALKBH8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ALKBH8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ALKBH8 em células tumorais com expressão de ALKBH8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.