AKR1D1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404897-ACT

AKR1D1 codifica a esteroide 5β-redutase, uma aldo-ceto redutase que catalisa uma etapa essencial na biossíntese de ácidos biliares ao converter Δ4-3-cetoesteroides em intermediários 5β-reduzidos. Essa atividade sustenta o catabolismo hepático do colesterol, a homeostase dos ácidos biliares e a sinalização metabólica a jusante por meio de receptores nucleares responsivos a ácidos biliares, como o FXR, conectando a AKR1D1 a vias regulatórias mais amplas de lipídios e glicose. Alterações na expressão ou na função de AKR1D1 podem perturbar a composição dos ácidos biliares e o metabolismo de esteroides, com relevância para fenótipos colestáticos e disfunção metabólica hepática. Como enzima enriquecida no fígado, a AKR1D1 é frequentemente estudada em modelos de hepatócitos para definir como o fluxo de ácidos biliares e a depuração de esteroides influenciam respostas inflamatórias e ao estresse metabólico.

AKR1D1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AKR1D1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AKR1D1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AKR1D1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AKR1D1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AKR1D1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AKR1D1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AKR1D1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AKR1D1 em células tumorais com expressão de AKR1D1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.