A20/TNFAIP3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423436-ACT

Tnfaip3 codifica A20/TNFAIP3, un enzima che modifica l’ubiquitina e che frena la segnalazione infiammatoria terminando l’attivazione delle vie NF-κB e MAPK a valle di recettori quali TNFR, i TLR e IL-1R. Attraverso attività coordinate di deubiquitinazione e di ligasi dell’ubiquitina, A20 modula catene di ubiquitina legate K63 e M1 su intermedi della segnalazione, tra cui RIPK1, TRAF6 e NEMO, plasmando la produzione di citochine e l’omeostasi immunitaria. Nei compartimenti immunitari e stromali del topo, un’alterazione della funzione di A20 è associata a risposte innate e adattative disregolate, sopravvivenza cellulare aberrante e maggiore sensibilità agli stimoli infiammatori. Tnfaip3 è quindi ampiamente studiato nei meccanismi dell’autoimmunità, dell’infiammazione cronica e della segnalazione del microambiente tumorale dipendente dal contesto.

A20/TNFAIP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tnfaip3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

A20/TNFAIP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tnfaip3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tnfaip3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di A20/TNFAIP3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tnfaip3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da A20/TNFAIP3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via A20/TNFAIP3 nelle cellule tumorali con espressione di Tnfaip3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.