5-LO Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401239-ACT

L’ALOX5 umano codifica la 5-lipossigenasi (5-LO), una diossigenasi non-eme contenente ferro che catalizza la conversione dell’acido arachidonico in intermedi dei leucotrieni, inclusi 5-HPETE e leucotriene A4. Questo passaggio enzimatico è al centro della biosintesi dei leucotrieni e coordina la segnalazione dei mediatori lipidici infiammatori attraverso vie autocrine e paracrine nelle cellule mieloidi e in altre popolazioni leucocitarie. L’attività della 5-LO si integra con il crosstalk della rete degli eicosanoidi, con l’attivazione calcio-dipendente e con le dinamiche di localizzazione subcellulare che modellano le risposte a valle, incluse quelle citochiniche e chemiotattiche. Una segnalazione ALOX5/5-LO deregolata è stata associata alla biologia delle malattie infiammatorie e al rimodellamento del microambiente immunitario, rendendola un nodo rilevante per studi meccanicistici di immunometabolismo e segnalazione lipidica.

5-LO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ALOX5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

5-LO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ALOX5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ALOX5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di 5-LO. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ALOX5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da 5-LO nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via 5-LO nelle cellule tumorali con espressione di ALOX5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.