14-3-3 ζ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400490-ACT

YWHAZ codifica a proteína adaptadora humana 14-3-3 zeta, um regulador que se liga a fosfoserina/fosfotreonina, estabiliza proteínas clientes e coordena a transdução de sinais em múltiplos compartimentos. A 14-3-3 zeta participa das vias PI3K–AKT, MAPK e do controle de checkpoints do ciclo celular ao modular a localização, o estado de fosforilação e a atividade de diversas quinases, fatores de transcrição e reguladores da apoptose. Por meio dessas interações, influencia a proliferação, a sobrevivência, as respostas ao estresse, a dinâmica do citoesqueleto e a sinalização metabólica. A desregulação da função de YWHAZ/14-3-3 zeta tem sido associada a alterações na sinalização oncogênica, a fenótipos de resistência a terapias e a processos neurobiológicos relevantes para a função sináptica e a proteostase.

14-3-3 ζ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de YWHAZ sem alterar a sequência de ADN subjacente.

14-3-3 ζ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus YWHAZ em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição YWHAZ, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de 14-3-3 ζ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus YWHAZ nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de 14-3-3 ζ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via 14-3-3 ζ em células tumorais com expressão de YWHAZ silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.