γ-GCSc Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401133-ACT

GCLC codifica a subunidade catalítica da ligase de glutamato–cisteína (γ-GCSc), a enzima limitante da velocidade na biossíntese de novo de glutationa, que liga glutamato e cisteína para formar γ-glutamilcisteína. Ao controlar a disponibilidade celular de glutationa, a γ-GCSc regula a homeostase redox, a capacidade de desintoxicação e a sensibilidade ao estresse oxidativo e eletrofílico. A expressão de GCLC está intimamente ligada à sinalização antioxidante NRF2/KEAP1 e se integra a vias que governam a ferroptose, a função mitocondrial e respostas inflamatórias ao estresse. O metabolismo desregulado da glutationa e a atividade alterada de GCLC têm sido associados à adaptação redox no câncer, neurodegeneração, doença metabólica e suscetibilidade a lesão por xenobióticos, tornando-o um nó-chave para estudos mecanísticos.

γ-GCSc O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GCLC sem alterar a sequência de ADN subjacente.

γ-GCSc O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GCLC em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GCLC, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de γ-GCSc. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GCLC nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de γ-GCSc no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via γ-GCSc em células tumorais com expressão de GCLC silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.