βB1-crystallin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403361-ACT

CRYBB1 codifica a βB1-cristalina, um importante componente estrutural do cristalino humano que contribui para a elevada densidade de empacotamento proteico, o índice de refração e a transparência a longo prazo. A βB1-cristalina participa da montagem do complexo de cristalinas e da maturação das células das fibras do cristalino, processos nos quais a proteostase e a resistência à agregação são essenciais para manter a clareza óptica. A desregulação da expressão de CRYBB1 ou da estabilidade da proteína tem sido associada a opacidades hereditárias do cristalino e a fenótipos relacionados à catarata, tornando-a um alvo útil para estudar agregação proteica, desenvolvimento do cristalino e vias de resposta ao estresse em modelos oculares. Pesquisas sobre CRYBB1 também esclarecem mecanismos de manutenção de proteínas de longa vida, modificações pós-traducionais e interações com chaperonas em tecidos terminalmente diferenciados.

βB1-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CRYBB1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

βB1-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CRYBB1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CRYBB1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de βB1-crystallin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CRYBB1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de βB1-crystallin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via βB1-crystallin em células tumorais com expressão de CRYBB1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.