β-Amyloid Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400520-ACT

APP codifica a proteína precursora do amiloide, uma glicoproteína transmembranar do tipo I que sofre clivagens sequenciais pelas secretases α, β e γ para gerar peptídeos, incluindo o β-amiloide. O processamento de APP influencia o tráfego endossomal, a função sináptica e a atividade neuronal, e integra-se a vias de transporte vesicular e de proteostase. A produção ou depuração desregulada de β-amiloide está fortemente associada à patologia relacionada à doença de Alzheimer e é amplamente estudada no contexto de neuroinflamação, estresse oxidativo e cascatas de sinalização amiloidogênicas. O APP humano e o β-amiloide também servem como importantes leituras moleculares para investigar a atividade de secretases, a biologia de microdomínios de membrana e respostas neuronais ao estresse.

β-Amyloid O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de APP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

β-Amyloid O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus APP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição APP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de β-Amyloid. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus APP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de β-Amyloid no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via β-Amyloid em células tumorais com expressão de APP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.