β8 Tubulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401438-ACT

TUBB8 codifica la β8-tubulina, un’isotipo di β-tubulina specifico dei primati che eterodimerizza con l’α-tubulina per formare i microtubuli, sostenendo l’organizzazione del citoscheletro, il trasporto intracellulare e la segregazione dei cromosomi durante la divisione cellulare. La dinamica dei microtubuli, regolata dalla composizione in isotipi di tubulina, influenza l’assemblaggio del fuso mitotico, la polarità cellulare e le vie di traffico che coordinano la mitosi e i primi processi dello sviluppo. Nell’uomo, le varianti di TUBB8 sono associate a difetti dell’integrità del fuso meiotico negli ovociti e della competenza embrionale precoce, rendendolo rilevante per studi di biologia riproduttiva e regolazione del citoscheletro. Un comportamento alterato della rete di tubulina è inoltre ampiamente informativo per modellare risposte allo stress, errori mitotici e fenotipi associati ai microtubuli in sistemi cellulari.

β8 Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TUBB8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

β8 Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TUBB8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TUBB8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di β8 Tubulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TUBB8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da β8 Tubulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via β8 Tubulin nelle cellule tumorali con espressione di TUBB8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.