Plasmide CRISPR d'Activation (m) α-actinin-1: sc-430958-ACT

Actn1 code l’α-actinine-1, une protéine de liaison à l’actine insensible au Ca2+ qui réticule la F‑actine et ancre les réseaux du cytosquelette aux complexes d’adhérence. Dans les cellules de souris, l’α-actinine-1 soutient l’organisation des fibres de stress, la maturation des adhérences focales et la mécanotransduction, influençant la forme cellulaire, la migration et la cytocinèse. Par ses interactions avec les intégrines, la vincul ine et des effecteurs de signalisation en aval des GTPases de la famille Rho, elle contribue au remodelage dynamique du cytosquelette d’actine et à la rigidité cellulaire. Une dérégulation de la fonction d’ACTN1 a été associée à des défauts du cytosquelette plaquettaire et à une altération de l’architecture tissulaire, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des phénotypes liés au cytosquelette et de leurs déterminants moléculaires.

α-actinin-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Actn1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

α-actinin-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Actn1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Actn1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de α-actinin-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Actn1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de α-actinin-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie α-actinin-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Actn1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.