Wip1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400980-ACT

PPM1D codifica a Wip1 (PPM1D), uma fosfatase de serina/treonina dependente de Mg2+/Mn2+ induzida por p53, que atua como um regulador central de feedback negativo da resposta a danos no DNA. A Wip1 desfosforila várias proteínas envolvidas em checkpoints e sinalização de estresse, incluindo p53, componentes da via ATM/ATR e nós de sinalização da p38 MAPK, moldando assim a recuperação dos checkpoints do ciclo celular, a estabilidade genômica e os limiares de apoptose. Ao modular essas vias, a Wip1 influencia as respostas ao estresse genotóxico e ao estresse de replicação, havendo relatos de alteração na atividade e no número de cópias de PPM1D em diversos contextos tumorais. A perturbação experimental de Wip1 é amplamente utilizada para dissecar a dinâmica de checkpoints, a sinalização adaptativa ao estresse e a comunicação cruzada entre vias que controlam a proliferação e a senescência.

Wip1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPM1D sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Wip1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPM1D em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPM1D, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Wip1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPM1D nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Wip1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Wip1 em células tumorais com expressão de PPM1D silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.