WAPL Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-432331-ACT

O gene WAPL (Wapl) de camundongo codifica um fator de liberação de coesina que regula a associação dinâmica da coesina com a cromatina, moldando a organização genômica de ordem superior e a coesão entre cromátides-irmãs. Ao promover o descarregamento da coesina durante a intérfase e a progressão mitótica, a WAPL influencia o timing da replicação do DNA, a regulação transcricional e a segregação cromossômica precisa. A atividade de WAPL cruza-se com processos de resposta a danos no DNA e de reparo ao modular a estabilização, dependente de coesina, de forquilhas de replicação estagnadas e de focos de reparo. A dinâmica desregulada da coesina e a expressão alterada de WAPL têm sido associadas à instabilidade genômica e a fenótipos ligados a coesinopatias, tornando Wapl um ponto útil para estudar a arquitetura da cromatina e o controle do ciclo celular em modelos relevantes para doenças.

WAPL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Wapl sem alterar a sequência de ADN subjacente.

WAPL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Wapl em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Wapl, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de WAPL. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Wapl nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de WAPL no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via WAPL em células tumorais com expressão de Wapl silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.