VPS4A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402005-ACT

O VPS4A humano codifica uma ATPase AAA+ que fornece energia para a desmontagem e a reciclagem do ESCRT-III, permitindo eventos de remodelamento de membrana necessários para a biogênese de corpos multivesiculares, a triagem de carga endossomal, a abscisão citocinética e o reparo da membrana plasmática. A atividade de VPS4A coordena-se com componentes do ESCRT para regular a downregulation de receptores, a biogênese de exossomos e microvesículas e o selamento do envelope nuclear após a mitose. Devido ao seu papel central no tráfego endolisossomal e na fissão de membranas, o VPS4A é frequentemente estudado em vias que afetam a proteostase, a sinalização imune inata e o brotamento viral que sequestra a maquinaria ESCRT. A desregulação das funções de ESCRT/VPS4 tem sido associada a fenótipos neurodegenerativos, alterações na sinalização de fatores de crescimento e mudanças, relacionadas ao câncer, no tráfego vesicular e na divisão celular.

VPS4A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VPS4A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPS4A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VPS4A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VPS4A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPS4A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VPS4A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPS4A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPS4A em células tumorais com expressão de VPS4A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.