VPS25 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404109-ACT

O VPS25 humano codifica uma subunidade central do complexo ESCRT-II, que coordena a triagem endossomal e a biogênese de corpos multivesiculares, permitindo que proteínas de membrana ubiquitinadas sejam direcionadas para degradação lisossomal. Por meio da remodelação de membranas dependente de ESCRT, o VPS25 contribui para a downregulation de receptores, a homeostase de proteínas de membrana e um controle mais amplo da intensidade e duração da sinalização. A maquinaria ESCRT também se articula com a citocinese e com a dinâmica de membranas relacionada à autofagia, vinculando a função do VPS25 à divisão celular e à proteostase adaptativa ao estresse. A desregulação do tráfego endossomal-lisossomal e de componentes da via ESCRT está associada a alterações na sinalização por fatores de crescimento, comprometimento do turnover proteico e fenótipos celulares relevantes para neurodegeneração e câncer.

VPS25 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VPS25 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPS25 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VPS25 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VPS25, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPS25. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VPS25 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPS25 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPS25 em células tumorais com expressão de VPS25 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.