VPS18 Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h): sc-405378

Visão geral

O VPS18 codifica uma subunidade central do complexo de ancoragem HOPS (homotypic fusion and protein sorting), que governa eventos de fusão entre endossomos tardios e lisossomos. Ao coordenar a ancoragem de vesículas com a fusão de membranas dependente de SNARE, o VPS18 sustenta a maturação endolisossomal, a capacidade degradativa lisossomal e o tráfego de carga necessário para a downregulation de receptores e o fluxo da via de autofagia–lisossomo. A perturbação do tráfego mediado por HOPS pode afetar a proteostase, a homeostase de organelas e as saídas de sinalização inata associadas a compartimentos endossomais. Dinâmicas endolisossomais alteradas envolvendo a maquinaria associada ao VPS18 têm sido estudadas no contexto de fenótipos neurodegenerativos, biologia de infeções e adaptação de células cancerígenas ao stress por vias dependentes de lisossomos.

O VPS18 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h) é um conjunto de plasmídeos concebido para a interrupção direcionada do gene VPS18 em human linhas celulares. Cada plasmídeo do conjunto coexpressa um sgRNA único, direcionado a um local distinto dentro do locus VPS18, juntamente com a nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes, e codifica GFP para permitir a identificação fluorescente e o enriquecimento das células transfectadas com sucesso. Esta estratégia multiguia aumenta a probabilidade de induzir deslocamentos de quadro de leitura ou deleções que produzam um knockout funcional, oferecendo uma alternativa mais robusta às abordagens de guia único. As DSBs induzidas em múltiplos locais são resolvidas através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou, quando utilizadas com o modelo doador HDR incluído, através da reparação dirigida por homologia (HDR) num local-alvo definido dentro do locus.

Quando utilizado em conjunto com o doador HDR que expressa RFP, a fluorescência de GFP e RFP pode ser utilizada em conjunto para distinguir populações de células transfectadas das editadas, simplificando os fluxos de trabalho de triagem e seleção de clones baseados em citometria de fluxo.

Doador de Reparação Dirigida por Homologia (HDR) — Cassete de Puromicina com Repórter RFP

Para aplicações que requerem clones knockout confirmados e selecionáveis, o VPS18 Plasmídeo HDR (h) inclui uma construção doadora HDR contendo uma cassete de resistência à puromicina (PuroR) e um repórter de proteína fluorescente vermelha (RFP), flanqueados por braços de homologia específicos para um local-alvo definido VPS18.
Quando co-transfectado com o VPS18 Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h):

• A cassete PuroR-RFP integra-se no local de corte da Cas9 através de HDR, interrompendo o quadro de leitura aberto VPS18.
  A fluorescência da RFP fornece um indicador visual imediato do sucesso da integração, permitindo a identificação ou triagem baseada na fluorescência das células editadas antes ou em paralelo com a seleção por puromicina.
  As células editadas com sucesso são confirmadas através da resistência à puromicina, reduzindo substancialmente a carga de triagem de clones.
  Esta estratégia de seleção é ideal para gerar linhas celulares KO clonais estáveis para estudos funcionais a jusante, triagem de fármacos ou desenvolvimento de modelos.

Sistema de remoção de cassete Cre-lox

A construção doadora HDR apresenta sítios loxP flanqueando a cassete de seleção PuroR-RFP para permitir a remoção limpa do marcador após a confirmação do clone. A expressão transitória da recombinase Cre através do Vetor Cre: sc-418923 incluído excisa a cassete, deixando um local loxP residual mínimo dentro do locus VPS18 e eliminando potenciais efeitos de confusão em ensaios a jusante.
Esta abordagem em duas etapas:

• Minimiza a perturbação da arquitetura local da cromatina e dos elementos reguladores vizinhos
  Restaura um contexto genómico quase nativo no locus editado
  Permite a reutilização da estratégia de seleção com puromicina na mesma linha celular para edições adicionais

Características principais

• gRNA direcionado para o(s) exão(ões) VPS18 crítico(s) para a função VPS18
  Coexpressão de SpCas9 e sgRNA a partir de um único plasmídeo para uma entrega simplificada
  Doador HDR com resistência à puromicina para seleção positiva de clones
  Cassete PuroR flanqueada por loxP com vetor de recombinase Cre para remoção contínua do marcador
  Fornecido pronto a usar para entrega por transfecção

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.