VPS16 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403914-ACT

O VPS16 humano codifica uma subunidade central dos complexos de ancoragem CORVET/HOPS, que coordenam eventos de fusão de membranas entre endossomos e lisossomos. Por meio de interações com GTPases Rab e com a maquinaria de SNAREs, o VPS16 sustenta o tráfego endolisossomal, a triagem de carga e a fusão entre autofagossomos e lisossomos, processos centrais para a proteostase celular e para a renovação de receptores. A perturbação dessas vias está associada a alterações da homeostase de sinalização e a mecanismos de doenças do neurodesenvolvimento e neurodegenerativas ligados à disfunção lisossomal. Assim, o VPS16 é amplamente utilizado como ferramenta molecular para estudar a ancoragem de vesículas, a biogênese de lisossomos e a autofagia responsiva ao estresse em modelos de células humanas.

VPS16 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VPS16 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPS16 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VPS16 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VPS16, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPS16. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VPS16 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPS16 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPS16 em células tumorais com expressão de VPS16 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.