VPS13A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407168-ACT

VPS13A codifica a proteína 13A associada à triagem de proteínas vacuolares, um grande fator de transferência de lipídios que se localiza em sítios de contato entre membranas e contribui para a homeostase lipídica, a dinâmica de organelas e o tráfego vesicular. O VPS13A está implicado na comunicação entre mitocôndrias e retículo endoplasmático, em processos relacionados à autofagia e na manutenção da integridade das membranas neuronais e dos eritrócitos por meio da regulação da distribuição de fosfolipídios. A disfunção do VPS13A está associada a fenótipos neurodegenerativos e à biologia de distúrbios do movimento, incluindo a patogênese da coreia-acantocitose, e tem sido cada vez mais estudada em contextos de respostas ao estresse celular e remodelamento de membranas. Como resultado, o VPS13A oferece um ponto de entrada mecanístico para investigar vias que acoplam o transporte intracelular à função mitocondrial e à neurobiologia.

VPS13A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VPS13A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPS13A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VPS13A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VPS13A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPS13A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VPS13A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPS13A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPS13A em células tumorais com expressão de VPS13A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.