VPAC2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402062-ACT

O VIPR2 humano codifica o recetor VPAC2, um recetor acoplado à proteína G da classe B para o peptídeo intestinal vasoativo (VIP) e o polipeptídeo ativador da adenilato ciclase hipofisária (PACAP). O VPAC2 acopla-se principalmente à Gs para aumentar o cAMP e ativar programas transcricionais dependentes de PKA, com efeitos adicionais na sinalização MAPK/ERK e na dinâmica do cálcio, dependendo do contexto celular. Este recetor modula a comunicação neuroendócrina, a regulação circadiana e metabólica e a atividade de células imunitárias ao moldar a sinalização de citocinas e a responsividade celular a neuropeptídeos. A desregulação da sinalização VIPR2/VPAC2 e variações no número de cópias têm sido associadas a fenótipos neuropsiquiátricos e do desenvolvimento, e a atividade alterada desta via tem sido estudada no âmbito da biologia de doenças inflamatórias e metabólicas.

VPAC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VIPR2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPAC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VIPR2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VIPR2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPAC2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VIPR2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPAC2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPAC2 em células tumorais com expressão de VIPR2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.