von Willebrand Factor/VWF Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400217-ACT

VWF codifica o fator de von Willebrand, uma grande glicoproteína multimérica produzida por células endoteliais e megacariócitos, essencial para a hemostase primária. O VWF medeia a adesão plaquetária ao colagénio subendotelial exposto sob elevada tensão de cisalhamento e estabiliza o fator VIII da coagulação, ligando a fixação das plaquetas à cascata de coagulação intrínseca. A proteína é armazenada em corpos de Weibel–Palade e em grânulos α das plaquetas e é regulada pelo processamento e clivagem dos multímeros, influenciando a trombose e a integridade vascular. A desregulação ou variação genética em VWF está associada a fenótipos hemorrágicos e trombóticos e é amplamente estudada em biologia endotelial, função plaquetária e investigação das vias de coagulação.

von Willebrand Factor/VWF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VWF sem alterar a sequência de ADN subjacente.

von Willebrand Factor/VWF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VWF em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VWF, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de von Willebrand Factor/VWF. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VWF nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de von Willebrand Factor/VWF no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via von Willebrand Factor/VWF em células tumorais com expressão de VWF silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.