Visual Arrestin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402997-ACT

O SAG codifica a arrestina visual (arrestina-1), uma proteína reguladora específica de fotorreceptores que encerra a sinalização da rodopsina ao se ligar à rodopsina ativada pela luz e fosforilada, modulando a fototransdução mediada pela transducina a jusante. Essa etapa de dessensibilização é essencial para a cinética de recuperação, a fidelidade do sinal e a proteção das células bastonetes contra a ativação excessiva da via de GPCR. A arrestina visual também contribui para o tráfego de receptores e para o equilíbrio da sinalização no segmento externo, integrando-se aos ciclos de fosforilação da rodopsina conduzidos pela GRK1. A desregulação ou variação patogênica em SAG está associada à disfunção retiniana hereditária, tornando-o um alvo-chave para estudos mecanísticos de estresse em fotorreceptores, vias de degeneração e transdução do sinal visual.

Visual Arrestin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SAG sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Visual Arrestin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SAG em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SAG, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Visual Arrestin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SAG nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Visual Arrestin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Visual Arrestin em células tumorais com expressão de SAG silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.