Villin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400587-ACT

VIL1 codifica a villina, uma proteína que se liga à actina e promove o seu corte, enriquecida nas microvilosidades epiteliais intestinais e renais, onde ajuda a estabelecer e a remodelar a borda em escova apical. A villina regula a organização do citoesqueleto, a polaridade epitelial e a motilidade celular por meio do controlo dependente de Ca²⁺ do empacotamento e do seccionamento da F-actina, ligando a dinâmica de membrana a programas de diferenciação em epitélios absortivos. Como marcador canónico da linhagem de enterócitos, alterações na expressão de VIL1 são frequentemente usadas para acompanhar mudanças de estado do epitélio durante inflamação, respostas a lesão e transformação oncogénica. Essas propriedades fazem da villina um ponto de partida útil para estudar a arquitetura das microvilosidades, a biologia da barreira e a sinalização dependente do citoesqueleto em modelos epiteliais humanos.

Villin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VIL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Villin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VIL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VIL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Villin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VIL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Villin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Villin em células tumorais com expressão de VIL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.