Plasmide CRISPR d'Activation (h) V-ATPase D1: sc-403669-ACT

ATP6V0D1 code la sous-unité D1 de l’ATPase à protons de type V (V‑ATPase), au sein du secteur membranaire V0, un composant central de la pompe rotative à protons qui acidifie les endosomes, les lysosomes et d’autres organites intracellulaires. Grâce à l’acidification des organites, l’activité de la V‑ATPase soutient l’endocytose médiée par les récepteurs, la protéolyse lysosomale, l’autophagie et le trafic vésiculaire, et elle contribue à l’homéostasie du pH dans de nombreux types cellulaires. Un assemblage correct de la V‑ATPase et la translocation des protons sont également importants pour les plateformes de signalisation endolysosomales, notamment les voies dépendantes de la fonction lysosomale, comme la détection des nutriments par mTORC1. La dérégulation de l’acidification et du trafic endolysosomaux est associée à la neurodégénérescence, à des réponses immunitaires altérées et à des phénotypes d’invasion liés au cancer, ce qui fait d’ATP6V0D1 une cible pertinente pour des études mécanistiques de la fonction des organites.

V-ATPase D1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP6V0D1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

V-ATPase D1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP6V0D1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP6V0D1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de V-ATPase D1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP6V0D1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de V-ATPase D1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie V-ATPase D1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP6V0D1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.