V-ATPase B2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401896-ACT

ATP6V1B2 codifica a subunidade B2 do domínio periférico V1 da H+-ATPase vacuolar (V-ATPase), uma bomba de prótons multissubunitária que hidrolisa ATP para acidificar endossomos, lisossomos e outros compartimentos intracelulares. Essa acidificação organelar é essencial para a endocitose mediada por receptores, o fluxo autofágico, a ativação de enzimas lisossomais e o tráfego vesicular, além de influenciar indiretamente a detecção de nutrientes e a adaptação metabólica ligada ao mTOR. Ao regular o pH luminal, a atividade da V-ATPase afeta o processamento e a degradação de proteínas, o processamento de antígenos e a reciclagem de proteínas de membrana. Vias desreguladas de acidificação de vesículas e lisossomos envolvendo componentes da V-ATPase têm sido associadas a fenótipos neurodoenvolvimentais e neurológicos e a distúrbios mais amplos do tráfego intracelular, tornando o ATP6V1B2 um ponto de interesse útil para estudar a proteostase e a disfunção endolisossomal.

V-ATPase B2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATP6V1B2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

V-ATPase B2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATP6V1B2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATP6V1B2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de V-ATPase B2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATP6V1B2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de V-ATPase B2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via V-ATPase B2 em células tumorais com expressão de ATP6V1B2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.