USP32 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-433591-ACT

Usp32 codifica l’enzima deubiquitinante USP32, una proteasi specifica per l’ubiquitina che inverte la coniugazione dell’ubiquitina per regolare la stabilità proteica, il traffico intracellulare e la trasduzione del segnale. Nell’ambito del controllo di qualità dipendente dall’ubiquitina, USP32 è implicata nel controllo della proteostasi e del turnover dei componenti delle vie di segnalazione che influenzano la progressione del ciclo cellulare, le risposte allo stress e la segnalazione associata alle membrane. La deubiquitinazione deregolata è di ampia rilevanza in oncologia e neurobiologia perché altera la degradazione delle proteine regolatorie e modifica gli output delle vie di segnalazione. Nei sistemi modello murini, la modulazione dell’attività di USP32 supporta studi meccanicistici sulle reti di segnalazione dell’ubiquitina e sul loro ruolo in fenotipi cellulari associati alla malattia.

USP32 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Usp32 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP32 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Usp32 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Usp32, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP32. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Usp32 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP32 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP32 nelle cellule tumorali con espressione di Usp32 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.