USP14 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403167-ACT

USP14 codifica uma enzima desubiquitinante associada à partícula reguladora 19S do proteassoma 26S, onde encurta cadeias de ubiquitina e modula o processamento de substratos antes da degradação. Ao controlar a reciclagem de ubiquitina e o fluxo de processamento do proteassoma, a USP14 influencia a proteostase celular, as respostas ao estresse e o equilíbrio entre controle de qualidade proteica e renovação. Essa atividade se cruza com vias que governam a progressão do ciclo celular, respostas a dano no DNA e redes de sinalização sensíveis à regulação dependente de ubiquitina. Alterações na função de USP14 têm sido estudadas em contextos de desequilíbrio de proteostase e de sinalização ubiquitina–proteassoma desregulada, relevantes para a neurobiologia e para fenótipos associados ao câncer.

USP14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de USP14 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

USP14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus USP14 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição USP14, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de USP14. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus USP14 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de USP14 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via USP14 em células tumorais com expressão de USP14 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.