UPIIIa Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401796-ACT

UPK3A codifica a uroplaquina IIIa (UPIIIa), uma proteína de membrana do tipo tetraspanina que se monta com outras uroplaquinas para formar placas cristalinas na superfície apical das células “guarda-chuva” do urotélio. Essas placas são essenciais para a diferenciação terminal do urotélio e contribuem para a integridade da barreira epitelial e para a estabilidade mecanomolecular durante o enchimento e o esvaziamento da bexiga. A UPIIIa participa da organização da membrana urotelial e do tráfego de vesículas associado à entrega dessas placas à superfície celular, conectando programas de diferenciação à biogênese especializada da membrana apical. Padrões alterados de expressão de uroplaquinas são usados para estudar o remodelamento urotelial e mudanças no estado de linhagem em contextos como respostas a lesões do epitélio vesical e a biologia do carcinoma urotelial.

UPIIIa O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UPK3A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UPIIIa O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UPK3A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UPK3A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UPIIIa. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UPK3A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UPIIIa no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UPIIIa em células tumorais com expressão de UPK3A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.