UKHC Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402349-ACT

KIF5B codifica a isoforma UKHC da cadeia pesada da cinesina-1, um motor baseado em microtúbulos que impulsiona o transporte anterógrado dependente de ATP de vesículas, complexos proteicos e organelos em células polarizadas. Por meio da coordenação com cadeias leves de cinesina e adaptadores de carga, o KIF5B sustenta o tráfego intracelular, a dinâmica do centrossoma e do fuso mitótico e a organização do citoesqueleto, influenciando assim processos como mitose, secreção e transporte neuronal. A atividade ou expressão desregulada de KIF5B pode perturbar a distribuição de organelos e a sinalização, e o KIF5B é frequentemente estudado no contexto de fusões génicas oncogénicas (por exemplo, KIF5B-RET) e de vias proliferativas alteradas. Estas características tornam o KIF5B um nó útil para investigar mecanismos de transporte em microtúbulos, controlo do ciclo celular e sinalização dependente de tráfego em modelos celulares humanos.

UKHC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KIF5B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UKHC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KIF5B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KIF5B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UKHC. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KIF5B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UKHC no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UKHC em células tumorais com expressão de KIF5B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.