UGT1A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417594-ACT

UGT1A8 codifica uma UDP-glucuronosiltransferase humana da família UGT1A que catalisa a glucuronidação de fase II de diversos xenobióticos e metabólitos endógenos, aumentando a sua solubilidade em meio aquoso para eliminação biliar e renal. Essa atividade enzimática vincula a UGT1A8 às redes de desintoxicação hepáticas e extra-hepáticas, em interseção com vias de metabolismo de fármacos e respostas celulares ao estresse químico. Variações ou alterações de expressão entre isoformas de UGT1A podem modificar a capacidade de glucuronidação e têm sido associadas a diferenças interindividuais na depuração de metabólitos e na suscetibilidade à carga de tóxicos. Assim, a UGT1A8 é relevante para estudos mecanísticos da bioquímica de conjugação, da regulação de enzimas metabólicas e de efeitos dependentes do contexto sobre a homeostase celular.

UGT1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UGT1A8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UGT1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UGT1A8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UGT1A8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UGT1A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UGT1A8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UGT1A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UGT1A em células tumorais com expressão de UGT1A8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.