UBE2B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404361-ACT

UBE2B (enzima E2 conjugadora de ubiquitina B) é uma enzima humana E2 conjugadora de ubiquitina que atua em parceria com ligases E3 para catalisar a transferência de ubiquitina para proteínas substrato, moldando a proteostase por meio do sistema ubiquitina–proteassoma. Ela contribui para a renovação proteica regulada e o controle de sinalização, com papéis estabelecidos em respostas a danos no DNA e em processos associados à cromatina, incluindo eventos de ubiquitinação que influenciam a escolha da via de reparo. Por meio dessas atividades, a UBE2B impacta a progressão do ciclo celular, a estabilidade do genoma e redes de sinalização de estresse. A ubiquitinação desregulada e a capacidade de reparo do DNA são amplamente relevantes para a oncogênese e outros distúrbios ligados à proteostase e à manutenção do genoma comprometidas, tornando a UBE2B um alvo útil para estudos mecanísticos.

UBE2B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UBE2B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UBE2B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UBE2B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UBE2B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UBE2B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UBE2B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UBE2B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UBE2B em células tumorais com expressão de UBE2B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.