Tyrosine Hydroxylase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400273-ACT

TH codifica a tirosina hidroxilase, a enzima limitante da velocidade na biossíntese de catecolaminas, que converte L-tirosina em L-DOPA, controlando assim a produção subsequente de dopamina, noradrenalina e adrenalina. Sua atividade integra-se ao metabolismo do cofator tetraidrobiopterina (BH4) e é regulada por vias de sinalização dependentes de fosforilação, que ajustam a liberação de neurotransmissores em resposta à atividade neuronal e a sinais de estresse. A expressão e o controle enzimático de TH são centrais para a identidade de neurônios dopaminérgicos e noradrenérgicos, para a transmissão sináptica e para a função neuroendócrina. A desregulação de TH e da homeostase de catecolaminas está implicada na biologia de doenças neurológicas e neuropsiquiátricas, incluindo distúrbios que afetam circuitos dopaminérgicos e a regulação autonômica.

Tyrosine Hydroxylase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Tyrosine Hydroxylase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Tyrosine Hydroxylase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Tyrosine Hydroxylase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Tyrosine Hydroxylase em células tumorais com expressão de TH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.