TRPM8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401744-ACT

TRPM8 (membro 8 da subfamília M dos canais catiônicos de potencial receptor transitório) é um canal iônico permeável a cálcio, sensível ao frio e ao mentol, que regula a excitabilidade da membrana e a sinalização intracelular de Ca2+. Em células humanas, a atividade de TRPM8 influencia a transdução sensorial, a responsividade osmótica e térmica e vias a jusante acopladas à transcrição dependente de Ca2+ e à sinalização por quinases. Alterações na expressão ou na função de TRPM8 têm sido associadas a mudanças na sinalização neuronal e no comportamento de células epiteliais, e o canal é frequentemente estudado no contexto da biologia do câncer, de distúrbios de dor e sensoriais e de processos associados à inflamação. Como canal de membrana plasmática, TRPM8 oferece um alvo acessível para investigar a regulação do estado celular, da migração e da dinâmica de sinalização evocada por estímulos, dependentes de canais iônicos.

TRPM8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TRPM8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TRPM8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TRPM8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TRPM8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TRPM8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TRPM8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TRPM8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TRPM8 em células tumorais com expressão de TRPM8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.