Trp7 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408046-ACT

TRPM2 (também conhecido como Trp7) codifica um canal cátionico não seletivo, permeável a Ca2+, da família TRP, que é ativado por ADP-ribose e regulado pelo estresse oxidativo intracelular. O influxo de Ca2+ mediado por TRPM2 acopla sinais redox a processos a jusante, incluindo a função mitocondrial, a produção de citocinas e quimiocinas, respostas associadas ao inflamassoma e programas de morte celular como apoptose e necroptose. O canal integra entradas do metabolismo de NAD+ e da sinalização dependente de PARP para moldar a homeostase de cálcio e respostas transcricionais adaptativas ao estresse. A atividade desregulada de TRPM2 tem sido implicada em mecanismos inflamatórios e neurodegenerativos, na biologia da lesão por isquemia-reperfusão e na sinalização do microambiente associada a tumores, sustentando sua relevância em modelos de dissecação de vias.

Trp7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TRPM2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Trp7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TRPM2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TRPM2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Trp7. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TRPM2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Trp7 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Trp7 em células tumorais com expressão de TRPM2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.