TRP2/DCT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400334-ACT

A DCT humana (dopacromo tautomerase), também conhecida como TRP2, é uma enzima melanosomal que catalisa a conversão de dopacromo em DHICA durante a biossíntese de eumelanina. Atua na rede melanogénica tirosinase/TRP1/TRP2 e contribui para a maturação dos melanossomas, a qualidade do pigmento e o equilíbrio redox nos melanócitos. A expressão de DCT é regulada por programas transcricionais de linhagem, como o MITF, e está associada a respostas de stress celular relacionadas com intermediários da melanina. A atividade e a expressão desreguladas de TRP2/DCT são frequentemente estudadas em fenótipos de pigmentação e na biologia do melanoma, incluindo o estado de diferenciação tumoral e contextos de sinalização associados a antigénios.

TRP2/DCT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DCT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TRP2/DCT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DCT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DCT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TRP2/DCT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DCT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TRP2/DCT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TRP2/DCT em células tumorais com expressão de DCT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.