Tropomyosin γ Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-425595-ACT

Tpm3 codifica a tropomiosina γ, uma proteína em hélice enrolada (coiled-coil) que se liga à actina e polimeriza ao longo da actina filamentosa para estabilizar os microfilamentos e modular as interações com motores de miosina. Em células de camundongo, isoformas de tropomiosina que contêm TPM3 ajudam a definir a identidade dos filamentos de actina, influenciando a organização de fibras de estresse, a dinâmica de adesões focais, a forma celular e a mecanotransdução. Por meio dessas funções, Tpm3 contribui para processos de remodelamento do citoesqueleto que afetam a migração celular, o tráfego intracelular e programas de diferenciação em contextos musculares e não musculares. Alterações na expressão ou na regulação de isoformas de TPM3 têm sido associadas na literatura a fenótipos relacionados ao citoesqueleto relevantes para a biologia do desenvolvimento e modelos de patologia, incluindo mudanças em redes de sinalização de adesão e motilidade.

Tropomyosin γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tpm3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Tropomyosin γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tpm3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tpm3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Tropomyosin γ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tpm3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Tropomyosin γ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Tropomyosin γ em células tumorais com expressão de Tpm3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.