Tropomyosin α Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401266-ACT

TPM1 codifica a tropomiosina alfa humana, uma proteína de hélice enrolada (coiled-coil) que se liga à actina, estabiliza a actina filamentosa e regula o acesso da miosina à actina no músculo estriado e liso, bem como em redes citoesqueléticas de células não musculares. Por meio da incorporação específica de isoformas nos filamentos finos, TPM1 ajuda a controlar a contratilidade, a forma celular, a adesão e a migração, integrando-se à dinâmica actomiosina e às vias de mecanotransdução. Alterações na expressão de TPM1 ou no equilíbrio entre isoformas têm sido associadas a cardiomiopatias e a fenótipos de remodelamento do citoesqueleto relevantes para disfunção muscular e motilidade de células cancerosas. Essas propriedades tornam TPM1 um alvo útil para estudar a organização do sarcômero, a montagem de fibras de estresse e respostas de sinalização dependentes de actina.

Tropomyosin α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TPM1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Tropomyosin α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TPM1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TPM1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Tropomyosin α. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TPM1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Tropomyosin α no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Tropomyosin α em células tumorais com expressão de TPM1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.