TRIM5α Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409348-ACT

TRIM5α (motivo tripartite contendo 5 alfa) é um fator de restrição induzível por interferon que reconhece capsídeos retrovirais e bloqueia a infecção por meio do desnudamento (uncoating) prematuro e da inibição subsequente da transcrição reversa. Como uma ligase E3 de ubiquitina com arquitetura RING–B-box–coiled-coil e um domínio PRY/SPRY de ligação ao capsídeo, a TRIM5α acopla o reconhecimento de padrões à sinalização dependente de ubiquitina e à proteostase, interagindo com vias da imunidade inata como NF-κB e respostas inflamatórias de citocinas. Variações em TRIM5 influenciam o espectro de hospedeiros e a suscetibilidade a retrovírus, tornando-a um alvo amplamente estudado na defesa antiviral, na regulação imune e na coevolução hospedeiro–patógeno. A detecção inata desregulada e a sinalização por ubiquitina envolvendo proteínas da família TRIM também são relevantes para patologias mediadas pelo sistema imune e respostas ao estresse celular.

TRIM5α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TRIM5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TRIM5α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TRIM5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TRIM5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TRIM5α. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TRIM5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TRIM5α no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TRIM5α em células tumorais com expressão de TRIM5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.