TPH2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402296-ACT

TPH2 (triptofano hidroxilase 2) codifica a enzima neuronal limitante da velocidade na biossíntese de serotonina (5‑hidroxitriptamina), catalisando a hidroxilação do L‑triptofano em 5‑hidroxi‑L‑triptofano em neurônios serotoninérgicos. Como um determinante-chave da disponibilidade de serotonina, a TPH2 influencia programas de neurotransmissão que modulam humor, responsividade ao estresse, regulação do ciclo sono–vigília, nocicepção e função autonômica. Alterações na expressão de TPH2 ou variações genéticas têm sido investigadas no contexto de fenótipos neuropsiquiátricos e do neurodesenvolvimento nos quais a sinalização serotoninérgica está implicada, incluindo traços afetivos e relacionados à ansiedade. Em modelos celulares, a atividade de TPH2 se cruza com vias que controlam o metabolismo de monoaminas, a plasticidade sináptica e a regulação gênica dependente de atividade.

TPH2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TPH2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TPH2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TPH2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TPH2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TPH2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TPH2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TPH2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TPH2 em células tumorais com expressão de TPH2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.