TPH Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402075-ACT

O gene humano TPH1 codifica a triptofano hidroxilase 1 (TPH), a enzima limitante da velocidade na biossíntese periférica de serotonina, que converte L-triptofano em 5-hidroxitriptofano. Ao controlar a disponibilidade de serotonina, a TPH1 influencia o metabolismo de monoaminas e a sinalização subsequente por meio de recetores serotoninérgicos que moldam a comunicação celular, a secreção e a fisiologia de barreiras. A atividade de TPH1 está ligada a vias que regulam a função gastrointestinal e enteroendócrina, o armazenamento de serotonina nas plaquetas e a comunicação cruzada neuroimune em tecidos periféricos. Alterações na expressão de TPH1 ou no equilíbrio de serotonina periférica têm sido associadas a perturbações que envolvem a sinalização do eixo intestino–cérebro, processos inflamatórios e regulação metabólica, tornando-a um alvo útil para estudos mecanísticos.

TPH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TPH1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TPH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TPH1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TPH1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TPH. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TPH1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TPH no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TPH em células tumorais com expressão de TPH1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.