TPCN2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402960-ACT

TPCN2 (canal de dois poros 2) codifica um canal catiônico endolisossomal que regula a liberação de Ca²⁺ a partir de reservas intracelulares ácidas em resposta ao NAADP e a sinais relacionados, coordenando o tráfego de membranas, a excitabilidade de organelas e a fusão de vesículas. Ao modular a dinâmica endossomo–lisossomo e a homeostase iônica, o TPCN2 influencia a autofagia, a reciclagem de receptores e processos de detecção de nutrientes ligados à sinalização de mTOR. Alterações na atividade de TPCN2 têm sido associadas a mudanças na biologia da pigmentação, a fenótipos metabólicos e a programas de invasão celular, tornando-o relevante para estudos de função lisossomal e adaptação ao estresse. Investigar o TPCN2 oferece uma via para dissecar como a sinalização endolisossomal de Ca²⁺ se integra à remodelação do citoesqueleto e à comunicação entre organelas em células humanas.

TPCN2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TPCN2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TPCN2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TPCN2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TPCN2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TPCN2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TPCN2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TPCN2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TPCN2 em células tumorais com expressão de TPCN2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.