TNAP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400784-ACT

ALPL codifica a fosfatase alcalina inespecífica de tecido (TNAP), uma ectoenzima ancorada por glicosilfosfatidilinositol que hidrolisa monoésteres de fosfato extracelulares para regular o equilíbrio entre fosfato inorgânico e pirofosfato. Ao controlar a disponibilidade de pirofosfato e gerar fosfato para a formação de hidroxiapatita, a TNAP é um regulador central dos programas de mineralização e da diferenciação de osteoblastos, além de se relacionar com a sinalização purinérgica por meio do metabolismo de nucleotídeos como o ATP. A atividade da TNAP também influencia a composição da matriz extracelular e a propensão à calcificação em tecidos ósseos e vasculares. A desregulação da função de ALPL/TNAP está associada à deposição mineral anormal e a fenótipos esqueléticos, tornando-a relevante para estudos de biologia óssea, vias de calcificação e homeostase do fosfato.

TNAP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ALPL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TNAP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ALPL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ALPL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TNAP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ALPL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TNAP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TNAP em células tumorais com expressão de ALPL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.