TM Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400956-ACT

THBD codifica a trombomodulina (TM), uma glicoproteína de superfície das células endoteliais que se liga à trombina e altera a sua especificidade de substrato, promovendo a ativação da proteína C e conectando o controlo da coagulação à sinalização anti-inflamatória. A TM participa na homeostase vascular ao modular vias dos recetores ativados por proteases (PAR) mediadas pela trombina, ao limitar a formação de fibrina e ao regular a barreira endotelial e as respostas de adesão de leucócitos. Alterações na expressão ou na função de THBD estão associadas a hemostase desregulada e a fenótipos vasculares inflamatórios, sendo frequentemente estudado em contextos como suscetibilidade à trombose, coagulopatia associada à sépsis e disfunção endotelial. Como marcador endotelial responsivo ao nível transcricional, THBD também serve como leitura de stress de cisalhamento, exposição a citocinas e programas de diferenciação vascular.

TM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de THBD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus THBD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição THBD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus THBD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TM em células tumorais com expressão de THBD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.