TLR4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400068-ACT

O TLR4 humano (receptor do tipo Toll 4) é um receptor de reconhecimento de padrões que detecta lipopolissacarídeo e outros padrões moleculares associados a patógenos e a dano na membrana plasmática. Após a ligação do ligante com co-receptores como MD-2 e CD14, o TLR4 inicia cascatas de sinalização dependentes de MyD88 e de TRIF que ativam NF-κB, AP-1 e IRF3, conduzindo programas transcricionais para citocinas inflamatórias e respostas de interferon tipo I. Essas vias coordenam a ativação da imunidade inata, o recrutamento de leucócitos e a comunicação com a imunidade adaptativa por meio de células apresentadoras de antígeno. A sinalização desregulada de TLR4 tem sido implicada em estados inflamatórios crônicos e em patologia imunomediada, e é amplamente estudada em contextos que incluem a biologia da sepse, a aterosclerose, a inflamação metabólica e a inflamação associada a tumores.

TLR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TLR4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TLR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TLR4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TLR4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TLR4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TLR4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TLR4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TLR4 em células tumorais com expressão de TLR4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.