TIM-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416365-ACT

HAVCR2 codifica a proteína 3 contendo domínio de imunoglobulina de células T e mucina (TIM-3), um recetor de checkpoint imunitário expresso em células T ativadas, células T reguladoras, células NK e subpopulações mieloides. A TIM-3 modula programas de ativação e exaustão imunitária por meio de sinalização dependente de ligandos com galectina-9, fosfatidilserina, CEACAM1 e HMGB1, influenciando os limiares de sinalização do TCR, a produção de citocinas e a deteção inata. Estes processos cruzam-se com vias inflamatórias e tolerogénicas que moldam as respostas antivirais, a evasão imunitária tumoral e a imunorregulação conduzida por células mieloides. Alterações na expressão e na sinalização de TIM-3 foram observadas em contextos de infeção crónica, autoimunidade e disfunção imunitária associada ao cancro, sustentando a sua utilização como marcador mecanístico de remodelação do estado imunitário.

TIM-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HAVCR2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TIM-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HAVCR2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HAVCR2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TIM-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HAVCR2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TIM-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TIM-3 em células tumorais com expressão de HAVCR2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.