THP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401238-ACT

UMOD codifica a uromodulina (THP), a glicoproteína mais abundante secretada na urina humana normal e um produto característico das células epiteliais do ramo espesso ascendente da alça de Henle. A THP é sintetizada no retículo endoplasmático, passa por extensa glicosilação e ancoragem por GPI, e é libertada no polo apical para influenciar a homeostase tubular, a agregação de proteínas e as interações com iões urinários e microrganismos. A expressão de UMOD e a maturação da proteína estão ligadas a vias de proteostase epitelial, incluindo o controlo de qualidade no RE e o tráfego através do complexo de Golgi, podendo modular a sinalização inflamatória no microambiente tubular renal. A variação genética ou a expressão desregulada de UMOD associa-se à suscetibilidade a doenças renais e a patologia túbulo-intersticial, tornando este locus útil para estudar a função do epitélio renal e as respostas ao stress.

THP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UMOD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

THP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UMOD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UMOD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de THP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UMOD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de THP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via THP em células tumorais com expressão de UMOD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.