TGIF Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401472-ACT

O TGIF1 humano codifica o TGIF, um regulador transcricional do tipo homeobox TALE que modula programas de expressão génica que controlam decisões de destino celular durante o desenvolvimento e a homeostase dos tecidos. O TGIF atua de forma proeminente como correpressor na transcrição dependente de TGF-β/SMAD, moldando os outputs de sinalização que influenciam a dinâmica epitélio–mesênquima, a proliferação e a diferenciação. Por meio de interações com SMADs e outros cofatores transcricionais, o TGIF ajuda a ajustar a amplitude e a duração da via, ligando sinais extracelulares ao controlo, ao nível da cromatina, dos genes-alvo. A atividade ou expressão desregulada de TGIF1 tem sido associada a estados alterados de sinalização de TGF-β, implicados em anomalias do desenvolvimento e em reprogramação transcricional relevante para a doença em contextos de investigação em cancro e fibrose.

TGIF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TGIF1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TGIF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TGIF1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TGIF1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TGIF. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TGIF1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TGIF no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TGIF em células tumorais com expressão de TGIF1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.