Plásmido CRISPR de Activación (m) TFIIIB'': sc-436781-ACT

El Bdp1 de ratón codifica una subunidad central del factor general de transcripción TFIIIB de la ARN polimerasa III (TFIIIB''), que coopera con TBP y las proteínas BRF para ensamblar el complejo de preiniciación en los promotores de la Pol III. Mediante esta actividad, TFIIIB'' sostiene la transcripción de pequeños ARN no codificantes, como los ARNt, y de otros transcritos dependientes de la Pol III, vinculando la función de Bdp1 con la capacidad de síntesis proteica, el crecimiento celular y los programas adaptativos al estrés. El control transcripcional de la Pol III está estrechamente conectado con vías de señalización sensibles a nutrientes y mitógenos, y con frecuencia se altera en contextos de proliferación desregulada. Dado que la producción de la Pol III influye en la homeostasis de la traducción y en la adaptación metabólica, la perturbación de Bdp1 ofrece un punto de entrada manejable para estudiar líneas de suministro transcripcionales que pueden desequilibrarse en estados asociados a enfermedades.

TFIIIB″ El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Bdp1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TFIIIB″ El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Bdp1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Bdp1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TFIIIB″. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Bdp1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TFIIIB″ en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TFIIIB″ en células tumorales con expresión de Bdp1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.