TFIIIB'' Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-436781-ACT

O gene Bdp1 de camundongo codifica uma subunidade central do fator geral de transcrição TFIIIB da RNA polimerase III (TFIIIB''), que coopera com TBP e proteínas BRF para montar o complexo de pré-iniciação em promotores da Pol III. Por meio dessa atividade, o TFIIIB'' sustenta a transcrição de pequenos RNAs não codificantes, como tRNAs e outros transcritos dependentes da Pol III, conectando a função de Bdp1 à capacidade de síntese proteica, ao crescimento celular e a programas de adaptação ao estresse. O controle transcricional da Pol III está estreitamente ligado a vias de sinalização responsivas a nutrientes e mitógenos e é frequentemente alterado em contextos de proliferação desregulada. Como a produção da Pol III influencia a homeostase traducional e a adaptação metabólica, a perturbação de Bdp1 oferece um ponto de entrada viável para estudar “linhas de suprimento” transcricionais que podem se desequilibrar em estados associados a doenças.

TFIIIB″ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Bdp1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TFIIIB″ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Bdp1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Bdp1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TFIIIB″. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Bdp1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TFIIIB″ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TFIIIB″ em células tumorais com expressão de Bdp1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.