Plásmido CRISPR de Activación (h) TFIIH p80: sc-402231-ACT

ERCC2 codifica la helicasa p80 de TFIIH (XPD) humana, una subunidad esencial del complejo TFIIH que acopla el desenrollamiento del ADN dependiente de ATP al inicio de la transcripción por la ARN polimerasa II y a la reparación por escisión de nucleótidos (NER). A través de sus funciones en la reparación acoplada a la transcripción y en la NER del genoma global, la p80 de TFIIH contribuye a la estabilidad del genoma al permitir el reconocimiento y la eliminación de lesiones voluminosas del ADN, como los fotoproductos inducidos por UV. ERCC2 también influye en la progresión del ciclo celular y en la respuesta celular al daño del ADN mediante la coordinación, mediada por TFIIH, de programas de reparación y transcripción. Las variantes patogénicas de ERCC2 se asocian con trastornos de reparación del ADN, incluidos el xeroderma pigmentoso, la tricotiodestrófia y el síndrome de Cockayne, lo que convierte a ERCC2 en un locus ampliamente utilizado para estudiar la disfunción de la NER y el acoplamiento entre transcripción y reparación.

TFIIH p80 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ERCC2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TFIIH p80 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ERCC2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ERCC2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TFIIH p80. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ERCC2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TFIIH p80 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TFIIH p80 en células tumorales con expresión de ERCC2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.