TFIIH p62 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402239-ACT

GTF2H1 codifica a subunidade p62 do TFIIH, um componente central do complexo TFIIH que coordena o início da transcrição pela RNA polimerase II com o reparo por excisão de nucleotídeos (NER). O TFIIH integra a abertura do promotor, a seleção do sítio de início de transcrição e o reconhecimento/reparo de danos no DNA por meio de interações com outras subunidades do TFIIH e fatores de reparo, conectando a transcrição basal à manutenção do genoma. Alterações na função do TFIIH e defeitos de NER estão associados à sensibilidade à radiação UV e a síndromes de reparo acoplado à transcrição, ressaltando a importância da p62 para as respostas celulares ao estresse genotóxico. Como um fator com função semelhante à de um arcabouço (scaffold) dentro do TFIIH, a p62 do TFIIH oferece um ponto acessível para investigar a comunicação cruzada entre a regulação transcricional e as vias de reparo do DNA.

TFIIH p62 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GTF2H1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TFIIH p62 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GTF2H1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GTF2H1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TFIIH p62. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GTF2H1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TFIIH p62 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TFIIH p62 em células tumorais com expressão de GTF2H1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.